1、哪種柱子可以反沖，哪種不可以?反沖后是正著用，還是反著用？

答：一般的正相、反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。

2、方法開發(fā)的時候，用乙腈和水作為流動相，在調(diào)整梯度的時候發(fā)現(xiàn)，剛開始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調(diào)到40%乙腈，RT沒有變化，30%也沒有變化，一直調(diào)到20%的時候，RT突然變到了約13分鐘，請問什么原因（用的是離子交換柱）？

答：離子交換柱的保留時間主要由洗脫液的離子強度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡單，需要把你的方法說的詳細一點才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況，其含有極性電離基團和非極性基團是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?對于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時候應(yīng)該怎樣進行活化及維護?為什么要這樣做?

3、對于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時候應(yīng)該怎樣進行活化及維護?為什么?

答：新柱活化，實際上是一個平衡的過程，除了用流動相平衡外，有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡，特別是測定分子量比較高的多肽，尤其重要。因為分子量高的物質(zhì)分子，擴散速度慢，平衡所需時間也相應(yīng)較長。具體平衡方式也很簡單，多進幾次樣品，直到峰面積和保留時間穩(wěn)定，再進行正式進樣測定。如果要加快平衡時間，把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進樣多針。用待測物對新柱平衡，目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。

4、如果柱子長時間不用，需要如何儲存?

答：對一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護。

5、什么原因?qū)е路灞仍瓉泶螅页霈F(xiàn)的早?

答：過快、過大的峰通常是由于從分流口和隔墊吹掃口排出的載氣減少，而更多的進入色譜柱;因此增加柱頭壓力，可降低分流比。檢查分流出品的氣體流量，如需調(diào)整分流比則對調(diào)整此流量。如果問題依然存在，可卸下并清潔分流口。這個問題也可能由于柱頭壓調(diào)節(jié)閥有問題而引起。

6、預(yù)柱或保護柱是不是必需？安裝保護柱后會影響樣品分析嗎?

答：加上保護柱，肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因為保護柱中間有著死體積的存在，但是如果保護柱接得好，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。

7、何時需更換隔墊或襯管?

答：通常比較好的隔墊至少能保證100次進樣不發(fā)生問題。當色譜特征說明襯管有問題時，需要更換襯管。影響隔墊壽命的因素有注射器尺寸、進樣口溫度和壓力，當然受壓力影響的程度比較小。影響襯管壽命的因素通常是樣品的清潔度。應(yīng)該根據(jù)儀器維護歷史記錄來選擇色譜需要的特定程序。

8、Atlantis C18柱可以用較高比例的流動相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護：流動相中不含緩沖鹽分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min流動相中含有緩沖鹽，分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易長菌，使用時間不可超過3天);水性柱保存體系也不特別：短期保存在所用的流動相中(不含緩沖鹽)，中長期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。

9、正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?

答：短期和長期都建議保存在正相測定所用的流動相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。

10、同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時為什么保留時間會提前?

答：色譜柱被強保留物質(zhì)污染后，保留時間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì)，還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜，有時候比較難預(yù)測是提前還是滯后。不過你平時維護的時候，注意在測定后將污染物用有機溶劑反沖清洗，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個分析方法用專門的色譜柱，長遠看，這樣更節(jié)省色譜柱的費用。

11、怎么通過選擇合適的柱子來提高分離度?

答：提高分離度可從三個主要影響因素來考慮，柱效、選擇性和保留因子?？赏ㄟ^減小填料粒徑和增加柱長提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性;有時候適當延長出峰時間增加保留因子，也可提高分離度。

12、流動相走空了，液相色譜柱還能用嗎?如果可以應(yīng)該如何再生?

答：能用的!可能柱子里會有氣泡進去，但之后多用流動相沖沖，看到基線穩(wěn)定，就沒問題了。用色譜柱的保存液低流速長時間沖洗，然后再檢測一下柱效，看柱子是否恢復(fù)，液相最好設(shè)置一下最低壓限，這樣就不怕流動相走光而會損傷色譜柱。

13、如何改善峰形?(前伸峰、拖尾峰)

答：前伸峰是由于色譜柱過載。當一種或多種化合物的進樣量超過色譜柱固定相容量時，可能發(fā)生這種情況。液相膜越薄，色譜柱中保留的每種化合物就越少。這涉及到進樣體積和進樣中每個峰的化合物濃度。通過減少進樣量、分流樣品或進樣濃度較低的樣品，可減小進樣體積。

14、氨基柱時，有時候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時間就又好了，什么原因，如何再生?如果可以沖的話，一般沖多久?

答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高(大約有1mol/L)，在有水存在的時候，在孔內(nèi)形成一個pH10左右甚至超過10的很強的堿性小環(huán)境，并會導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過硅膠基體的溶解會生成酸性的硅醇基，又會降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進程。一段時間后，兩個相反的過程會達成一個動態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來。對你問題提到的這個現(xiàn)象，我想到的是這個原因。

氨基柱，要看氨基柱的應(yīng)用模式，是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式應(yīng)用，一般流動相是乙腈/水，是不怕水的。不過鍵合氨丙基基團非常容易水解，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時，流動相中要求一點都不能含水，但清洗柱子上的污染物質(zhì)，是可以含水的，因為水有強極性，在正相色譜上洗脫能力極強，當然不必用100%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。

15、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會對柱子有什么損壞嗎?pH在2左右。

答：pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動相中，也不必過份擔心，最多相當于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點，保存期間水分揮發(fā)可能會導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對柱子損傷很大。

16、色譜柱的安裝有什么技巧?還有所謂的死體積怎么測定呢?

答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質(zhì)出峰時從進樣到流過色譜柱的總體積，一般用極性非常強的尿嘧啶的出峰來測定。死體積包括柱體積(色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積)和柱外體積兩部分。你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進樣器內(nèi)死體積、毛細管長度、毛細管和色譜柱連接緊湊與否，保護柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對這個有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴散外，還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外，那就只有擴散這個使柱效下降的因素了。

所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進樣量、樣品溶劑、流動相組成(包括添加劑)、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。

17、柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會有什么不良后果?

答：不建議將柱篩板拆下清洗，因為拆下承壓的柱篩板會導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對污染的色譜柱先進行清洗維護，維護沒有效果，再把拆洗柱篩板作為最后的手段。

18、CN基柱應(yīng)該怎樣維護才好呢?比如做完實驗用什么流動相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長期用什么溶劑保存等等。

答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護辦法和一般正相和反相柱沒有多大區(qū)別。

19、色譜分析運行時，標樣和樣品的峰均隨時間加寬

答：如果保留時間沒有很大區(qū)別，只是加寬的峰拖尾，可能表明有活化點。如果加寬的峰是對稱的，可能是由于正常的色譜柱“損耗和流失”。如果峰前伸，說明色譜柱過載。

20、排除色譜柱流失問題的最佳方法是什么?

答：診斷色譜柱是否存在流失問題的最佳方法是第一次在方法條件下安裝色譜柱時，做一次空白色譜圖，然后將最近的運行和空白運行色譜圖對比。如果在空白運行中產(chǎn)生了很多峰，則色譜柱性能改變，這可能是由于載氣中含有氧氣，也可能是由于樣品殘留。如果有GC-MS，則低極性色譜柱的典型流失離子(例如DB/HP-1或5)質(zhì)/荷比m/z將為207、73、281、355等，大多數(shù)為環(huán)硅氧烷。

21、請問我做一種藥的分析，查美國藥典規(guī)定使用100mm×40mm8μm色譜柱，流速3mLmin。可現(xiàn)在市場上已不容易找到這種規(guī)格的產(chǎn)品，于是我按USP中色譜柱比較的數(shù)據(jù)庫的指引，選了一款選擇性一致的等價色譜柱，其規(guī)格是100mm×46mm3μm的色譜柱，當選用3mLmin的流速時發(fā)現(xiàn)柱壓超高，請問我如何對方法進行調(diào)整以滿足USP的要求?

答：流速調(diào)整原則是流動相通過柱子的線速度一致，等價柱的截面積大了，流速也應(yīng)增加才能保持相同的線速度。新流速計算結(jié)果是：(4.6/4.0)2x3.0=4.0ml/min。但3ml/min流速都已導(dǎo)致柱壓太高，4.0ml/min明顯不行。好在USP還有個允許±50%的流速調(diào)整指導(dǎo)原則，這樣將流速調(diào)至2.0ml/min既符合USP規(guī)定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。這個例子中，等度分析中，流速改變會引起塔板數(shù)和峰寬的改變，但不會影響峰的選擇性。3um粒徑色譜柱柱效比8um的高很多，可考慮縮短柱長以補償或部分補償流速降低造成的測定時間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運行，可以在符合USP規(guī)定的情況下，又得到更快速的測定分離。

22、最近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿意的結(jié)果。有人建議我對色譜條件，如進樣量、流動相pH和溫度等，進行微調(diào)以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規(guī)定我不能這樣做，怎么辦?

答：如果你心里老有這個思維定勢“按規(guī)定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦!只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結(jié)果，你才能發(fā)現(xiàn)問題所在。如果改變條件后，仍得不到好結(jié)果，就要去找色譜條件以外的原因，如色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過程中的是否存在問題?不管通過微調(diào)你是否取得了好結(jié)果，你也有了向領(lǐng)導(dǎo)匯報問題和解決方案的依據(jù)。而且，絕對不能調(diào)整藥典規(guī)定色譜條件的說法通常是不對的。美國藥典USP說的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗證，但方法調(diào)整或者稱微調(diào)以符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗證的。USP列了調(diào)整的幾條指導(dǎo)原則，如±50%的流速調(diào)整，±10℃的溫度調(diào)節(jié)等等(詳見"Chapter 621，Chromatography，" United States Pharmacopeia No. 31-NF 26， (2008).)。當然既然是指導(dǎo)原則，這些規(guī)定都不是絕對的，如溫度調(diào)整±10℃，對有些方法適用，對另外的方法則±5°C的調(diào)整都會有問題，我們應(yīng)該依據(jù)具體情況作出明智的科學判斷。

23、峰形后拖尾是什么原因造成的?

答：[柱物理損壞] 色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。

[柱內(nèi)填料污染] 流動相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。流動相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純試劑。流動相所用的水最好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45um溶劑微孔過濾(器)過濾，除去可能存在的微粒。流動相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對于含鹽的溶液尤其注意長置會產(chǎn)生細菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲存流動相的容器清潔。

復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過濾(器)或樣品預(yù)處理柱對樣品進行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護柱。柱內(nèi)填料污染時，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)?；蛞阅苋芙馕廴疚锏牧鲃酉喟瓷V柱使用的相反方向，沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積，或視具體情況而定;另外，此時不能接檢測器)，將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標明的使用方向使用。

[柱進口處有異物] 當斷定是柱進口處有異物時，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。

[樣品濃度過高致使柱超載] 樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾(或伸舌)。適當減小進樣量或樣品濃度(需要時，可提高檢測器靈敏度)直至峰形和保留時間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進樣量保持在3～50ug范圍內(nèi)，不會引起明顯超載。

[樣品溶劑不對] 選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾。最好選用流動相溶解樣品。

[柱外效應(yīng)]即進樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積，是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實柱效等情況發(fā)生。

[緩沖不足或不合適] 在緩沖不好或離子強度過低的分離中，也會出現(xiàn)保留時間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。

[硅醇基團作用] 仔細分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃酉嗉尤?5mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團發(fā)生強烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用，以保證保留機理正常進行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但持續(xù)力較三乙胺長。因為抑制劑分子中除了胺基與硅醇基團發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中，效果會顯著。

[柱內(nèi)金屬污染] 柱內(nèi)金屬污染(Fe，Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進，也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的金屬濾片，隨流動相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱的。

---文字由實驗與分析編輯整理